NanocoulterⅠ纳米库尔特单颗粒分析仪——

　　一种全“芯”的瑞芯细胞外囊泡检测手段

　　细胞外囊泡(ExtracellularVesicles,EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm不等。智造

　　图1细胞外囊泡的单颗形成过程

　　胞外囊泡主要由微囊泡(Microvesicles,MVs)和外泌体(Exosomes,Exs)组成，微囊泡是粒检细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的测媲小囊泡，直径约为100nm–1000nm。美电外泌体(exosome)是镜的精度简单检测一种由细胞释放到细胞外基质的膜性小囊泡，直径约为40-100nm(有说30-150nm，瑞芯目前尚无定论)，智造广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、单颗淋巴液、粒检唾液、测媲尿液、美电精液、镜的精度简单检测乳汁)中，瑞芯携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎症疾病以及癌症中都发现细胞外囊泡水平的升高，它们很有可能成为这类疾病的诊断标志物。

　　相比外泌体研究遍地开花的火热程度(仅国内6月份就有217篇相关论文)，外泌体纯化和提取方法可谓是差强人意。目前主流的方法有超速离心(UC)、密度梯度离心(DGC)、免疫捕获、聚合物沉淀(Precip)、超滤(UF)、排阻色谱(SEC)，以及微流控分析芯片等。往往一种提取方法无法得到足够纯度、浓度的外泌体，每种方法的适用样品种类也不一样。

　　国际细胞外囊泡学会(ISEV)在2014年提议，对于分离获得的外泌体需要从三个层面进行鉴定：(1)WesternBlot(WB)鉴定外泌体表面标志物;(2)透射电镜(TEM)鉴定外泌体形态;(3)粒径分析鉴定外泌体大小。免疫印迹与电镜观察耗时长、操作复杂、价格昂贵，在实际研究中难以做到每个外泌体样本都去做WB与TEM，所以急需一种快速简便的粒径分析方法，来作为外泌体鉴定的“先锋部队”。

　　NanocoulterⅠ“芯”方式助力外泌体提取纯化研究

　　NanocoulterⅠ单颗粒检测，可液体活检、一个样本测试仅需5-10分钟，测试样本零污染可回收等特性，恰好贴合该需求，目前已经广泛应用于细胞外囊泡(外泌体)的提取鉴定工作中。

　　图2NanocoulterⅠ外观

　　NanocoulterⅠ原理

　　纳米库尔特原理，测试过程是将待测外泌体分散在电解液中，随其通过特定孔径的纳米孔芯片，外泌体通过纳米孔的一瞬间会占用相同体积电解液的位置，在孔内外两电极间的电阻(恒电流设计的电路)会发生瞬时变化，产生电位脉冲。脉冲信号的强度和次数与通过纳米孔的外泌体颗粒大小及数目成一定比例，直接将脉冲信号进行转换，即可获得检测样品中外泌体的粒径和粒子数信息。

　　图3NanocoulterⅠ原理图

　　图4NanocoulterⅠ核心技术

　　NanocoulterⅠ性能参数

　　检测的粒度范围：40nm-2μm

　　尺寸测定精度：1nm

　　浓度范围：1E+06~1E+12个/mL

　　样本量：50μL

　　重复性误差：<10%

　　粒径准确性误差：<10%

　　浓度准确性误差：<20%

　　外泌体样本快速检测粒径分布、浓度：

　　随着研究的深入，更多的分离提取外泌体的方法被开发出来，也有多种提取方法联用的方式，看似百花齐放，实则良莠不齐，甚至都不尽如人意。NanocoulterⅠ逐个测量外泌体粒径，得到外泌体的真实粒径浓度分布，可快速判断提取方法的优劣。

　　图5不同分离提取方法的外泌体粒径测定

　　NanocoulterⅠ单颗粒检测，得到所有颗粒的真实分布状况，快、准、狠地判别提取方法的优劣性，大大节省了时间和人力成本。

　　NanocoulterⅠ“快”

　　测量核心元器件芯片，采用激光刻蚀，纳米孔一致性非常高，并且所有对标信息均已装入检测卡中的二维码中，因此仪器无需再次校准、对标等繁琐测试前步骤，节省了大量宝贵的时间。一卡一码，扫描二维码，加入样本，即可开始测试。并且样本只存在于插入式检测卡样品槽中，检测过程中不影响外泌体活性，宝贵的外泌体样本测试完成后可回收做后续研究。

　　图6NanocoulterⅠ检测卡

　　NanocoulterⅠ“准”

　　NanocoulterⅠ的原理决定测得的数据为真实粒径信息，无需经过反演算或者推导得出，并且配备多种尺寸的已知粒径和浓度的标准颗粒(60-300nm，20nm一个梯度)来作为基线数据，实现测量数据的定量校准，确保粒径、浓度数据的绝对准确。无论是不同粒径的混合样本，还是有细微差异的同粒径样本，均能准确无误的辨别出来。

　　图7不同厂家生产的标准微球的细微差异

　　NanocoulterⅠ“狠”

　　NanocoulterⅠ在经典库尔特原理的基础上，深耕微纳加工技术十余年，具有原子级别(1纳米以下)精度微加工能力，最高分辨率可达1nm。纳米孔每通过一个颗粒就产生一个电位脉冲，因此样本中所有外泌体颗粒均能准确测量，实现真正意义上的的单颗粒检测。测试过程可直观的看到外泌体样本中外泌体颗粒的真实分布情况，测试完成即可立即输出报告。

　　图8外泌体样本检测信号脉冲图

　　图9外泌体样本测试报告

　　外泌体除开在疾病诊断、载药等医学方面的研究，目前在美容保健等领域也得到了不少的开发与利用，越来越多学者投入外泌体的研究，瑞芯智造(深圳)科技有限公司开发的NanocoulterⅠ纳米粒度仪将始终是你研发路上的好伙伴。

　　全文摘自：瑞芯智造：www.resunbio.com

　　文中所提到的NanocoulterI单颗粒检测技术请联系陶工(13612883919)

　　参考文献：

　　Isolationandcharacterizationofurinaryextracellularvesicles:implicationsforbiomarkerdiscover.NATUREREVIEWS|NEPHROLOGY,10.1038/nrneph.2017.148.

　　Higherfunctionalityofextracellularvesiclesisolatedusingsize-exclusionchromatographycomparedtoultracentrifugation，Nanomedicine:Nanotechnology,BiologyandMedicine，2017

　　EvaluationofserumextracellularvesicleisolationmethodsforprofilingmiRNAsbynext-generationsequencing，JournalofExtracellularVesicles，2018.

　　Comparisonofsmallextracellularvesiclesisolatedfromplasmabyultracentrifugationorsize-exclusionchromatography:yield,purityandfunctionalpotential，JournalofExtracellularVesicles，2019.